ELEKTROPORACJA KOMÓREK EUKARIOTYCZNTYCH

Literatura:

S.C. Spencer (1991). Electroporation technique of DNA transfection. W: Methods in Molecular Biology, Vol. 7. Gene transfer and expression protocols, 45-53. Murray E.J. i Walker J.M. (red.), Humana Press Inc., Clifton, N.J.

Instrukcja obsługi firmy BTX.

Andreason G.L. i Evans G.A. (1989). Optimization of electroporation for transfection of mammalian cell lines. Anal. Biochem., 180, 269-275.

Założenia:

Elektroporacja to jedna z podstawowych metod wprowadzania genów do komórek. Wykorzystuje ona przejściowe (czasowe) uszkodzenie błony komórkowej pod wpływem przyłożonego wysokiego napięcia. Napięcie to destabilizuje błonę komórkową, w błonie tworzą się pory, przez które DNA wnika do komórek.

Do przeprowadzenia elektroporacji wykorzystywany jest elektroporator firmy BTX 830.

Komórki eukariotyczne wymagają niskich napięć, dużej pojemności i dobrze przewodzących medium typu: PBS^– lub medium wzrostowego z 10% surowicą (+FBS).

Opis procedury:

Elektroporacja in vitro

1. Przygotować zawiesinę komórek: na 1 podanie: 100000 komórek/100 ml PBS^–.
2. Przygotować roztwór DNA: 6 mg DNA w 25 ml PBS^–.
3. Zawiesinę komórek (100 ml) umieścić w kuwecie o odległości ścianek 1 mm i dodać roztwór DNA.
4. Inkubować komórki z DNA 5 min. w łaźni lodowej.
5. Zaraz po elektroporacji do kuwety z zawiesiną komórek dodać 875 ml medium wzrostowego z surowicą i antybiotykami, przełożyć komórki do probówki typu „eppendorf”.
6. Starannie „rozdzielić komórki” i przełożyć do 2 ml medium wzrostowego z surowicą i antybiotykami na płytkę 24-dołkową.

Optymalne warunki elektroporacji dla linii komórkowej B16(F10)

Napięcie:               40-80 V

Czas impulsu:       70 msec

Ilość impulsu:       1 impuls

Elektroporacja in vivo

1. W przypadku elektroporacji guzów odpowiednio wcześniej zaszczepić myszy komórkami nowotworowymi, tak by w dniu elektroporacji guzy miały wielkość
   6 mm.
2. Przed elektroporacją (najlepiej dzień przed) wygolić myszy w miejscu wprowadzenia genów.
3. Przed podaniem DNA i elektroporacją myszy uśpić 15-17 ml 2,5% Avertin/1 g wagi ciała (~ 300 ml mysz).
4. W miejscu elektroporacji wprowadzić 10 mg DNA w 100 ml PBS^– (mięśnie nastrzykiwać w dwóch miejscach po 50 ml, guzy nastrzykiwać raz 100 ml).
5. Po wprowadzeniu DNA wykonać elektroporację w optymalnych warunkach dla danej linii komórkowej. Zaraz po elektroporacji myszy do momentu wybudzenia owinąć ligniną albo zapobiec wyziębieniu.
6. W przypadku wprowadzenia genu reporterowego po 24 godzinach wykonać analizę aktywności enzymatycznej.

Optymalne warunku elektroporacji

Mięśnie

a)    Napięcie:                   100 V

Czas impulsu:           100 msec

Ilość impulsu:           5 impulsów

Odległość elektrod:    5 mm

b)    Napięcie:                   900 V

Czas impulsu:           150 ms

Ilość impulsu:           5 impulsów

Odległość elektrod:    5 mm

Guzy

Napięcie:                            200 V

Czas impulsu:           100 msec

Ilość impulsu:           1 impuls

Odległość elektrod:    3 mm