TRANSFEKCJA Z LIPOFEKTYNĄ

Opis procedury:

1. I.                   Przygotowanie komórek do transfekcji.
   1. Dzień przed transfekcją „posiać” komórki na płytkach o średnicy 6 cm w ilości 3 x 10⁵ komórek na płytkę w 5 ml medium z dodatkiem 10% surowicy (+FBS).
   2. Inkubować komórki przez noc w temp. 37°C i 5% CO₂.
2. II.                Przygotowanie kompleksów DNA-lipidy.
   1. Przygotować w probówkach polistyrenowych (firmy ROTH) roztwór lipidów: 20 mg lipidów, tj. 20 ml w Opti-MEM w końcowej objętości 100 ml (w przypadku transfekcji bez surowicy) lub dejonizowanej H₂O (w przypadku transfekcji w obecności surowicy).
   2. Inkubować roztwór lipidów 45 minut w temperaturze pokojowej.
   3. W międzyczasie, przygotować roztwór DNA (10 mg DNA w Opti-MEM w końcowej objętości 100 ml w przypadku transfekcji bez surowicy lub dejonizowanej H₂O w przypadku transfekcji z surowicą).
   4. Po upływie 45 minut inkubacji do roztworu lipidów dodać roztwór DNA, a powstałą mieszaninę transfekcyjną dokładnie wymieszać i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej (R.T.).
   5. W przypadku transfekcji bez surowicy (-FBS) należy pamiętać o wcześniejszym odpłukaniu surowicy z płytek z komórkami (odpłukać 5 ml medium bez surowicy, -FBS).
   6. Dodać do mieszaniny transfekcyjnej 3 ml odpowiedniego medium (+FBS lub –FBS) i natychmiast przenieść na płytkę z komórkami, z której uprzednio usunięto medium.
   7. Inkubować komórki w mieszaninie transfekcyjnej 4 godziny (jest to optymalny czas transfekcji) w temp. 37°C i 5% CO₂.
   8. Po upływie tego czasu ściągnąć z płytek medium z mieszaniną transfekcyjną i zastąpić je 5 ml właściwego medium z 10% surowicą (+FBS) i antybiotykami.
   9. Inkubować komórki 48 godzin w temp. 37°C i 5% CO₂.

Odczynniki:

Roztwór DNA

Lipidy kationowe:

-        Lipofektyna (1 ml zawiera 1 mg firmy GIBCO BRL)

Media i inne roztwory:

-        Opti-MEM – medium ze zredukowaną ilością surowicy (firmy GIBCO BRL),

-        Medium wzrostowe bez surowicy (-FBS),

-        Medium wzrostowe + 10% surowica (+FBS),

Medium wzrostowe + 10% surowica + antybiotyki (penicylina: 100 j./ml medium, streptomycyna: 100 mg/ml medium

Literatura:

Instrukcja firmy GIBCO BRL dotycząca transfekcji przy użyciu Lipofektyny.