TRANSFEKCJA KOMÓREK – OGÓLNE WIADOMOŚCI

Założenia:

Istnieje szereg metod wprowadzania genów do komórek eukariotycznych. Poza rzadkimi przypadkami, kiedy udaje się wprowadzić DNA (tzw. „nagie” DNA) bezpośrednio do komórek eukariotycznych (głównie komórek mięśniowych) i poza stosowaną fizyczną metodą przejściowego uszkadzania błony komórkowej pod wpływem przyłożonego wysokiego napięcia (tzw. elektroporacją), na ogół wprowadza się DNA  w postaci kompleksów, które wiążą się z błonami komórkowymi i ułatwiają transport DNA do wnętrza komórki. Wykorzystuje się np. tworzone kompleksy DNA z fosforanem wapnia (precypitacja z fosforanem wapnia) lub DEAE-dekstranem.

Najczęściej jednak geny terapeutyczne wprowadzane są do komórek nowotworowych przy użyciu tzw. nośników genów. Najogólniej nośniki w terapii genowej można podzielić na konstruowane na bazie wirusów (np. wektory retrowirusowe czy adenowirusowe) i nośniki niewirusowe (głównie lipidy kationowe i polimery kationowe). Na korzyść nośników niewirusowych przemawia brak ryzyka rekombinacji genetycznych i mutacji typu insercji występujących w przypadku stosowania nośników wirusowych, duża pojemność dla terapeutycznego DNA i możliwość wielokrotnych iniekcji (lipidy oraz polimery kationowe nie są bowiem immunogenne) zwiększających skuteczność transfekcji in vivo. W transfekcjach przy udziale kationowych nośników, ważne jest opracowanie optymalnych warunków formowania kompleksów nośników DNA, tzn. określenie odpowiednich stosunków wagowych składowych komponent lipidowych w przypadku lipidów kationowych, dobranie odpowiednich ilości DNA użytego do kompleksowania z nośnikami genów.

Kompleksowanie DNA z cząsteczkami kationowych nośników (powstawanie tzw. lipopleksów w przypadku kationowych lipidów lub polipleksów w przypadku kationowych polimerów) powoduje zmniejszanie rozmiarów cząsteczek DNA (powstawanie kompleksów DNA-nośnik można obserwować poprzez pojawiającą się opalizację płynu, w którym zachodzi kompleksowanie lub poprzez zatrzymywanie kompleksów DNA-nośnik na żelu agarozowym). Wstępne wiązanie DNA z polikationami (np. poli-L-lizyną, poli-L-ornityną), poprzedzające późniejsze kompleksowanie prekondensowanego DNA z nośnikami kationowymi typu: lipidy kationowe lub kationowe polimery, dodatkowo zmniejsza wymiary kompleksów nośnik-DNA i zwiększa wydajność transfekcji.

Oddziaływania między kationowymi nośnikami, ujemnie naładowanym DNA i ujemnie naładowaną powierzchnią błony komórkowej odbywają się na zasadzie łączenia przeciwnie naładowanych cząstek. Zaadsorbowany na powierzchni komórek kompleks (DNA + nośnik) jest wchłaniany do komórek na zasadzie endocytozy. Następnie powstały pęcherzyk endosomalny ulega rozbiciu, a kompleks uwalniany jest do cytoplazmy. Nie jest znany mechanizm transportu DNA z cytoplazmy do jądra komórkowego. Pojawienie się egzogennego DNA w jądrze ma pewien związek z zanikiem błony jądrowej podczas podziałów komórkowych. Zaobserwowano bowiem, że procent komórek transfekowanych in vitro jest znacznie większy, gdy komórki dzielą się intensywnie.

Wszelkie analizy oceniające skuteczność wprowadzania genów przeprowadza się zwykle 48 godzin po transfekcji.

Literatura:

-        DNA transfection techniques. Viral infection techniques (1991). W: Methods in Molecular Biology, Vol. 7. Gene transfer and expression protocols, 3-244. Murray E.J. i Walker J.M. (red.). Humana Press Inc., Clifton, N.J.

-        Fiend D.S., Papahadjopoulos D. i Debs R.J. (1996). Endocytosis and intracellular processing accompanying transfection mediated by cationic liposomes. Biochim. Biophys. Acta 1278, 41-50.

-        Gao X. i Huang L. (1991). A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Bioch. Biophys. Res. Commun. 179, 280-285.

-        Gao X. i Huang L. (1995). Cationic liposome-mediated gene transfer. Gene Ther. 2, 710-722.

-        Ledley F.D. (1995). Nonviral gene therapy: the promise of genes as pharmaceutical products. Hum. Gene Ther. 6, 1126-1144.

-        Michael S.I. i Curiel D.T. (1994). Strategies to achieve targeted gene delivery via the receptor – mediated endocytosis pathway. Gene Ther. 1, 223-232.

-        Singhal A. i Huang L. (1994). Gene transfer in mammalian cell using liposomes as carriers. W: Gene Therapeutics: Methods and application of direct gene transfer. Editor: J.A. Wolff (red.). Birkhäuser, Boston, 118-142.

-        Sochanik A. i Szala S. (1997). Kompleksy kationowych polimerów z DNA w terapii genowej nowotworów. Współczesna Onkologia 2, 5-10.