OZNACZANIE ILOŚCI ŻYWYCH KOMÓREK WYBARWIONYCH ROZTWOREM BŁĘKITU TRYPANU

Założenia:

         Błękit trypanu barwi jedynie martwe komórki. Ponieważ ma większe powinowactwo do białek z surowicy niż białek komórkowych, przed oznaczaniem należy dokładnie odpłukać komórki od medium z surowicą.

Opis procedury:

1. Porządnie odpłukać komórki od medium z surowicą.
2. Komórki umieścić najlepiej w buforowanych roztworach soli, np. PBS (bez jonów Ca²⁺ i Mg²⁺).
3. Przenieść 0,5 ml 0,4% r-ru błękitu trypanu do probówki „eppendorf”, dodać
   0,3 ml PBS^- oraz 0,2 ml zawiesiny komórek w buforze PBS^-; końcowa objętość mieszaniny – 1 ml.
4. Dokładnie wymieszać komórki i pozostawić je w temperaturze pokojowej na 5-15 minut (barwienia nie przedłużać!).
5. Liczyć komórki w komorze Bürkera:

Objętość komory wynosi 0,0001 cm³ (0,0001 ml)

Ilość komórek w 1 ml wynosi więc: 10.000 x średnia ilość komórek x współczynnik rozcieńczenia (w tym wypadku współczynnik rozcieńczenia wynosi 5, ponieważ na 1 ml mieszaniny przypada 0,2 ml wyjściowej zawiesiny komórek, czyli 1/5 objętości).

Ilość komórek w badanej objętości: ilość ml zawiesiny komórek x 10.000 x średnia ilość komórek.

Ilość przeżywających komórek (%) oblicza  się wg wzoru:

Odczynniki:

-        0,4% błękit trypanu (Nr katalogowy T 8154, firmy SIGMA),

-        PBS^-.

Literatura:

Patterson M.K. Jr. (1979) Measurement of growth and viability. W: Methods in Enzymology. Vol. LVIII (1979). W.B. Jakoby i I.H. Pastan (red.). Academic Press Inc. California.

Katalog firmy SIGMA.